Kolumnen för en högpresterande vätskekromatografi (HPLC) maskin är den stationära fasen av extraheringen. Den flytande-vanligtvis en buffertlösning-ständigt strömmar över kolumnen är den mobila fasen. Eftersom kemikalier sprutas in i HPLC de flyter med den mobila fasen över kolonnen och eluera vid olika och specifika tider för att producera ett kromatogram. Höjden på toppar på kromatogrammet säger vilken mängd av kemikalien i din analyserade provet. Kolumn frågor orsaka dåliga resultat, så felsökning är viktig.
Du behöver:
HPLC maskin
. Analytisk standard i önskad koncentration.
Injektionsspruta (om det behövs).
Ny kolumn (om det behövs).
1.
Starta HPLC och låt det utjämna för den tid som är standard i din lab-protokollet. Under tiden utgör den analytiska standard (er) som används på din HPLC (detta varierar beroende på vad din labb och HPLC-analyserna). När maskinen är skakad, injicera en standard på maskinen-detta kommer antingen göras för hand med en spruta eller genom att läsa din maskins autosampler.
2.
Titta på kromatogrammet produceras av standarden. Detta är din bästa indikationen för kolumn problem. Följande steg kommer att peka ut gemensamma frågor kolumn hittades från detta kromatogram
3
Kontrollera elueringstiden -. . Den tid det tar för standardens topp ska visas. Resultaten kommer att variera för olika kemikalier, men din lab bör ha ett "bästa fall" dags för en topp ska visas. Om de högsta dyker upp väldigt tidigt, indikerar detta att materialet i din kolumn är att bryta ner och kolumnen behöver bytas ut. Om toppen är väldigt långt ut kan detta tyda på kolonnen inte var väl förberedd. I detta fall kan kolumnen fortfarande användas om toppen är fortfarande tillräckligt bra för ditt lab behov (ju längre elueringstiden, desto mindre topp kommer att bli).
4.
Undersök formen på topp. Helst du vill ha en topp som stiger kraftigt och har en symmetrisk form. Ett stort "Hill-liknande" topp anger material i kolumnen bryter ner liksom en topp som "svansar"-har en längre sluttning vid ena änden än den andra. I båda dessa fall kan kolumnen fortfarande användas om resultaten är tillräckligt bra för dina behov. För att förlänga livslängden på den kolumn som du kanske kan "flip" det (ta bort kolumnen och vrida den att flyta motsatt sätt). Detta kan på nytt förpacka materialet inuti, men fungerar inte alltid.
5.
Undersök baslinjen (raderna som ledde fram till din topp). Om linjen är inte jämn, detta kallas "brus" i baslinjen. Sharp, är naggad buller sannolikt elektrisk, men slumpmässiga "skakig" brus kan indikera kolumnen har föroreningar. Försök att köra färsk mobil fas över kolonnen att rengöra den. Om det fortfarande är bullrig, följ ditt labb protokoll att rekonditionera kolumnen. Om det fortfarande är bullrig du kommer att behöva ersätta den kolumnen. Vissa ljud kan tolereras så länge det inte stör dina avläsningar.
Tips och varningar
- HPLC felsökning kräver tålamod. Prova en sak i taget för att lösa problem och låt den gott om tid att balansera mellan dina försök.
- alltid din mobil fas och injektionsspruta ren. Rör inte nålen på sprutan med händerna eller så kan du införa hudfett i kolonnen.
- Använd standardprotokoll labb säkerheten vid arbete på HPLCs.
