välkommen give2all.org RSS | Lägg till favoriter | Sitemap

hur isolera mRNA från en cell

Postad av : Magnus Ekblad

En cell genetiska blåkopia är kodad i dess genetiska material, eller DNA. Eftersom DNA aldrig lämnar cellkärnan, för att denna information att komma in i cytoplasman där andra proteiner och komponenter biokemiska bor, är det nödvändigt att först transkribera DNA till budbärar-RNA (mRNA eller poly (A) RNA). Denna mRNA då blir översatt till proteiner som utför många funktioner i cellen. Att upptäcka eller kvantifiera mycket sällsynta mRNA, göra prober för microarrays eller bygga bibliotek av kompletterande DNA-molekyler, måste mRNA isoleras. De totala RNA (dvs alla RNA i en cell) extraktion och därpå följande mRNA isolering inte utesluta varandra, den förra måste utföras för att mRNA som ska extraheras

Du behöver:
laminärt flöde skåp. .
Personlig skyddsutrustning.
Grundläggande laboratorium verktyg (pipetter, tips, Biohazard bortskaffande) och maskiner (centrifuger, värme block).
RNAse-fri lab bänkar.
RNAzap eller RNAoff.
mRNA utsugspaket från Invitrogen, Ambion etc.
Natriumacetat.
Etanol.
Isopropanol.
Diethylpyrocarbonate.
Avjoniserat vatten.
UV Spektrofotometer och förbrukningsvaror.
Celler för RNA-extraktion.
TRIzol eller TRIreagent.
RNas hämmare

Isolering av mRNA från Total RNA


1
TRIzol homogenisering. . Totala RNA inkluderar alla mRNA, överföring RNA, ribosomala RNA och andra icke-kodande RNA. Att skilja dessa från andra cellulära komponenter, är cellen först öppnat för att frigöra dess innehåll. Detta görs genom resuspending celler pelleterat genom centrifugering (roterar med hög hastighet) i TRIzol Reagent (Life Technologies). Andra versioner av TRIzol (t. ex. Ambion's TRI Reagent) fungerar på liknande sätt
2
totala RNA Isolering:. . En serie centrifugering är användas för att separera de olika komponenterna (proteiner, DNA, RNA) i cellen i lager, eller faser, inom suspension. Den översta, gulfärgade fasen består av fett och kan kasseras. Den önskade fasen är tonad röd, innehåller den totala RNA och bibehålls. Efter att ha utfört en fenol-kloroformextraktion och en rad alkohol tvättar med användning av isopropanol och etanol, kan RNA pelleterat för mRNA isolering. Lägg RNas hämmare för att förhindra detta enzym från att försämra den totala RNA
3
mRNA Extraktion:. . Det är vanligt att använda ett kit för att isolera mRNA, som hemmagjord labb protokoll inte genererar stora mängder av renade mRNA. Kommersiella kit inkluderar Invitrogen s FastTrack 2. 0 eller Ambion's Poly (A) Pure mRNA Isolering Kit. Dessa grundläggande åtgärder är gemensamma för sådana byggsatser:

a) Blanda RNase-hämmade lyseringsbuffert i kitet med upp till 300 mikroliter av den totala RNA

b) Värme. i 5 minuter vid 65 grader Celsius och sedan omedelbart får provet svalna på is under en minut.

c) Blanda detta med 0,5 M natriumklorid och sedan helt upplösa Oligo DT (oligodeoxythymidylic syra) i detta prov.

d) Centrifugera detta urval och återhämta supernatanten som tvättas flera gånger i en serie bindande och låg salt buffertar anges i byggsatser.

e) Eluera mRNA flera gånger tills ett kit specificerad volym (t. ex. 500 mikroliter) erhålls.

f) Utfällning eluatet genom natriumacetat och etanol nederbörd. Återsuspendera i upp till 20 mikroliter av diethylpyrocarbonate (DEPC) behandlade-vatten.

g) Lagra vid -80 grader och kontrollera kvalitet och kvantitet med spektrofotometri.

tips och varningar


Håll
  • alla reagenser , celler och RNA kallt genom att sänka ner i isen. Detta förhindrar att RNA från att försämras på något annat enzymer som blivit släpps under homogenisering processen.
  • Reagenser som TRIzol är giftiga och får inte vara i kontakt med hud eller slemhinnor. Alltid säkert labb protokoll vid hantering av denna reagens.
    
    Copyright © 2011 give2all.org