Enligt University of Wisconsin BioWeb webbplats är en PCR primer en kort, syntetiska oligonukleotiden (vanligtvis mellan 18 till 25 baser långa) användas för att förstärka specifika regioner av DNA i en molekylärbiologisk teknik som kallas polymeras kedjereaktion (PCR). Både framåt och bakåt primer behövs, utformad för att vända kompletterar av DNA-strängen, att omge och binder till den önskade DNA regionen. När forskare vill forska på en specifik gen eller en region av DNA, måste de först för PCR att förvärva tillräckligt av målregionen att arbeta med. Utforma primer sekvenser för regionen av intresse kan vara nödvändigt om de inte redan finns tillgänglig genom tidigare publicerats forskning eller genom kommersiella medel
Du behöver:. .
Nukleotidsekvensen mål-DNA regionen
Primer design mjukvara eller websida.
1.
Skaffa nukleotidsekvensen av genen eller DNA regionen av intresse och bestämmer hur länge en skärva som du vill förstärka. Framåt och bakåt primer är utformad för att binda i början och slutet av det önskade fragmentet. Vanligtvis konventionell PCR-metoder använda primers som flanken en region mellan 100 till 1. 000 baspar lång, medan realtids-PCR metoder använder fragment cirka 50 till 200 baspar långa.
2.
Bestäm där i den ordning du vill att grundfärger att ljuga. Till exempel kanske du vill att läget nära 5 "eller 3" slutet av sekvensen eller i mitten. Om så önskas, utse platsen för grundfärger att span en intron.
3.
Följ de rekommenderade riktlinjerna för primer design. Framgångsrik amplifiering av DNA-produkt som beror på kvaliteten av primers och vissa variabler är kritiska.
4.
Design primers vara 18 till 24 baser i längd. Vincent R. Prezioso, Ph. D. , från Brinkmann Instruments Inc. , tyder på att denna längd är tillräckligt lång för att vara extremt specifika för den önskade DNA regionen, men tillräckligt kort för att binda (glödga) lätt. Primer smälttemperatur (Tm) bör mellan 55 till 80 grader, tillräckligt låg för att tillåta fullständig smältning vid eller över 90 grader Celsius, men tillräckligt hög för att glödgning. Den GC innehåll (i procent av GS och Cs i sekvensen) bör vara mellan 40 och 60 procent. De 3 "slutet av primer sekvens måste sluta med en C eller G (sk GC klämma) för att främja bindande, eftersom G och C nukleotider har starkare band dock undvika med tre eller flera GS eller Cs under de senaste fem baser i sekvensen.
5.
Undvik att ha serier av fyra eller fler av en bas (som ACCCC . . . ) eller fyra eller fler di-nukleotid upprepar (som ATATATAT . . . ) eftersom de kan orsaka mispriming. Design grundfärger utan inom primer homologi (mer än tre baser som kompletterar inom en primer själv) eller inter-primer homologi (där framåt och bakåt primer har komplettera sekvenser). Detta kan orsaka själv dimerer eller primer-dimer, där primers binder till sig istället för bindning till den önskade DNA-sekvensen.
6.
Använda online-resurser och webbplatser som hjälper i primer design eller hjälpa kontrollera primer sekvenser för egna komplementaritet eller det möjlighet att göra sekundära strukturer som hårnålar. Vissa primer design webbplatser omfattar Massachusetts Institute of Technology's primer3, Nationellt centrum för bioteknik Informations Primer-Blast och integrerade DNA Technologies OligoAnalyzer.
