Proteiner är stora molekyler bildas av kedjor av aminosyror som fälls in. tredimensionella strukturer. Proteiner eller komplex av proteiner utföra många av de viktigaste uppgifterna i cellen, allt från katalysera reaktioner på strukturella funktioner. Biologer behöver ofta att isolera ett visst protein för fortsatta studier eller för andra tillämpningar. De använder olika tekniker för att göra det
SDS-PAGE gelelektrofores
Med den här tekniken är de proteiner först behandlats med rengöringsmedel kallade natriumdodecylsulfat eller SDS, denaturering dem och får dem att förlora sin struktur. Den negativt laddade molekyler tvättmedel bildar komplex med proteiner. Ofta en kemikalie som heter merkaptoetanol läggas för att bryta någon disulfidbindningar mellan cystein rester i proteinet också. Därefter är det protein blandningen tillsätts brunnar i en platta av polyakrylamidgel och ett elektriskt fält får dem att flytta i riktning mot den positivt laddade anoden. Mindre proteiner kommer att migrera snabbare medan större proteiner kommer att migrera långsammare, så proteiner kan skiljas på grund av sin storlek eller molekylmassa.
Sedimentation Velocity Equilibrium
En centrifug är i huvudsak två beväpnade rotor med ett rör i varje ände. En motor snurrar rotorn vid mycket höga hastigheter, utsätts innehållet i varje rör till en kraft många gånger starkare än gravitationskraften. Proteiner i lösningen kommer successivt migrera mot botten av röret, vissa av dem kommer dock göra det snabbare än andra. Jämvikt sedimentering arbete som bygger på en liknande princip men lägger till en twist: provet är spridd inom en densitetsgradient bestående av en hög koncentration av sackaros eller cesiumklorid. Som centrifugen snurrar, proteiner i provet gradvis migrering till den plats där dess densitet är samma som för sin omgivning.
Kolonnkromatografi
Kromatografi är en kraftfull teknik som innebär att tvinga en blandning genom en kolonn packad med en porös matris av pärlor eller små partiklar. Lösningsmedel flödet från toppen av kolumnen skjuter blandningen genom matrisen, men vissa proteiner eller föreningar i blandningen interagera mer med den matris än vad andra och därmed tar längre tid att växa fram. Genom denna process kan kolonnkromatografi separera en blandning i sina beståndsdelar. Det finns ett antal olika varianter på den här samma grundläggande idé. Jonbyteskromatografi, använder till exempel en matris som består av pärlor som antingen positivt eller negativt laddade, så att proteiner från motsatt laddning finns kvar i kolumnen. Affinitetskromatografi använder pärlor eller partiklar belagda med en molekyl som binder till ett specifikt protein i blandningen --- en antikropp, till exempel, eller substratet av ett enzym (molekylen enzymet agerar på). Proteinet av intresse kommer att finnas kvar i kolumnen medan alla andra passera och kan tas bort senare genom att ändra pH eller lägga till en koncentrerad saltlösning.
Isoelektrisk fokusering
Isoelektrisk fokusering innebär också gelelektrofores, men proteinerna är inte förbehandlat att denaturera dem. Istället läggs de till en polyakrylamidgel platta där speciella buffertar har använts för att skapa en pH-gradient. Beroende på deras struktur, olika proteiner har olika isoelektrisk poäng eller pH-värden där de inte har någon nettoladdning. När ett elektriskt fält tillämpas kommer varje protein migrera tills den når sin isoelektrisk punkt.
